Рефераты по медицине
Анализ качественных и количественных характеристик антибиотиков
Скачать реферат [33,3 Кб] Информация о работе
Содержание
Введение
1. Качественное определение антибиотиков
2. Количественное определение антибиотиков
2.1 Микробиологическое исследование антибиотиков
2.1.1 Методы разведений
2.1.2 Турбидиметрические методы
2.1.3 Методы диффузии в агар
2.2 Определение отдельных составных частей антибиотиков
2.3 Химические и физико-химические методы определения антибиотиков
2.3.1 Химические методы
2.3.2 Оптические методы. Колориметрия и спектрофотометрия в видимом свете
2.3.3 Спектрофотометрия в ультрафиолетовом свете
2.3.4 Инфракрасная спектроскопия
2.3.5 Флюорометрия
2.3.6 Оптическое вращение
2.3.7 Электрохимические методы
2.3.8 Полярография
2.3.9 Амперметрическое (полярометрическое) титрование
2.3.10 Кондуктометрия
2.3.11 Радиоактивные изотопы в анализе антибиотиков
2.4 Количественное определение некоторых антибиотиков
2.4.1 Пенициллин
2.4.2 Стрептомицин
2.4.3 Тетрациклины
2.4.4 Левомицетин
2.4.5 Эритромицин
2.4.6 Неомицин
2.4.7 Флоримицин
2.4.8 Грамицидин С
2.4.9 Циклосерин
Заключение
Список использованной литературы
Введение
Антибиотики − органические соединения, образуемые микроорганизмами и обладающие способностью в незначительных концентрациях избирательно тормозить рост других микроорганизмов или убивать их. Это определение, справедливое в отношении большинства антибиотиков, не является, конечно, исчерпывающим настолько, чтобы оно охватывало все вещества, входящие в данную группу. Чтобы уточнить понятие "антибиотик", необходимо дополнить его определение несколькими примечаниями.
1. Ряд микроорганизмов вырабатывает вещества, обладающие способностью тормозить рост других микроорганизмов, но, несмотря на это, они не могут быть причислены к антибиотикам. Это, например, органические кислоты, этиловый спирт, перекись водорода и некоторые другие вещества, действие которых проявляется в значительно более высоких концентрациях, нежели у антибиотиков.
2. Среди антибиотиков можно выделить также антибиотически активные вещества, получаемые из зелёных растений, так называемые фитонциды. Сюда относятся, например, хлорелин, аллицин, томатин, антибиотик из настурции (Tropaelum majus). Среди антибиотиков в широком смысле слова можно выделить и антибиотически активные вещества животного происхождения. Это, например, экмолин − препарат, получаемый из органов рыб и зарекомендовавший себя как средство для лечения ряда заболеваний, а также как средство, продлевающее действие пенициллина, стрептомицина и других антибиотиков. Другими примерами могут служить препараты, поучаемые из членистоногих, среди которых, например иридомирмецин, выделенный из экстракта одного из видов тропических муравьёв, имеет очень широкий антимикробный спектр и вдобавок обладает инсектицидным действием. В настоящее время известно очень много антибиотиков, поэтому, чтобы легче ориентироваться, их необходимо разделить на несколько групп.
3. Отдельные антибиотики, которые первоначально были обнаружены и выделены как продукты обмена определённых микроорганизмов, т.е. получены путём биосинтеза, можно получать и производить также и методами химического органического синтеза. Эти антибиотики, следовательно, являются переходными между собственно антибиотиками и химиотерапевтическими средствами. Химиотерапия в самом широком смысле слова есть лечение химическими веществами. В более узком смысле слова химиотерапия есть лечение инфекционных болезней химическими веществами, что прежде всего предполагает специфическое действие последних на определённый вид или целую группу патогенных микробов.
Для того чтобы быть хорошим лечебным средством, каждый антисептик должен обладать несколькими основными свойствами.
1. Антибиотик должен при низкой концентрации (не выше 10-50 мкг/мл) убивать болезненные микроорганизмы или, по крайней мере, останавливать их размножение. Иными словами, препарат должен обладать в очень низкой концентрации бактерицидными или хотя бы бактериостатическим действием.
2. Активность антибиотика против болезнетворных микроорганизмов не должна сколько-нибудь существенно снижаться под действием жидкостей тела, как, например, сыворотка крови, лимфа, гной
3. Воздействие на микроорганизмы должно быть быстрым. Болезнетворные микроорганизмы не должны приобретать устойчивость (резистентность) против антибиотика быстрее, чем антибиотик подавит их размножение.
4. Антибиотик не должен ни в коей мере вредить макроорганизму (человеку). Он не должен обладать токсичностью ни непосредственно после введения разовой дозы, ни хронически, т.е. после многократного введения в течение нескольких дней. Он не должен также наносить вред тканям макроорганизма при непосредственном контакте с препаратом, например при парентеральном введении.
5. Антибиотик не должен существенно снижать иммунологические реакции, в частности, нарушать образование антигенов, вырабатываемых организмом против болезнетворных микробов. Равным образом препарат не должен нарушать фагоцитоз.
6. Антибиотик не должен препятствовать процессу выздоровления.
Указанными свойствами различные антибиотики обладают лишь до известной степени. Из всех применяемых антибиотиков наиболее полно указанным выше требованиям удовлетворяет пенициллин. Применение антибиотиков в настоящее время не ограничивается лишь областью медицины. Антибиотики с огромным успехом используют как добавки в корма сельскохозяйственных животных, для лечения заболеваний растений, как средства, предотвращающие инфицирование в бродильной, консервной и других отраслях промышленности. Пока ещё не ясно, какое место займут антибиотики в качестве стимуляторов роста растений.
1. Качественное определение антибиотиков
Задача качественно определить неизвестный антибиотик встаёт как при изучении новых антибиотиков, так и в практике, если нужно показать присутствие антибиотика в фармацевтических препаратах. Обе задачи требуют совершенно различных методов. Самым надёжным методом идентификации антибиотика является определение его инфракрасного спектра. Результаты здесь абсолютно однозначны. Только после измерения инфракрасного спектра можно с полной уверенностью судить об отличии или идентичности двух антибиотиков различного происхождения. Поскольку инфракрасным спектрофотометром оснащена не каждая лаборатория, то для идентификации антибиотиков были разработаны системы простых химических реакций, довольно надёжных для идентификации известных антибиотиков.
Для быстрого качественного определения антибиотиков в фармацевтических препаратах очень удобна осциллографическая полярография. При хорошо подготовленной аппаратуре можно за несколько минут идентифицировать большинство ныне применяемых антибиотиков. Практически наиболее важным являются разграничение тетрациклиновых антибиотиков от хлорамфеникола, а также проверка состояния и чистоты пенициллиновых препаратов, причём важно быстро установить, до какой степени препарат разложился. Другим быстрым физическим методом идентификации антибиотиков является определение показателя преломления твёрдого вещества. В табл. 2 приведены величины показателей преломления для обычно применяемых антибиотиков в твёрдом состоянии.
Таблица 1 Перечень химических тестов для качественного определения антибиотика
Бацитрацин
Фумагиллин
Карбомицин
Эритромицин
Грамицидин
Тиротрицин
Полимиксин В
Виомицин
Неомицин
Тетрациклин
Окситетрациклин
Хлортетрациклин
Хлорамфеникол
Дигидрострептомицин
Стрептомицин В
Стрептомицин А
Эфинамн-пенициллин
Прокаин-пенициллин
Пенициллин G (К-соль)
Тест
+
+
+
Гидроксиламин+FeCl3
+
+
Мальтольная реакция (на стрептозу)
+
+
+
+
Реакция Эльсона − Моргана (на глюкозамин)
+
+
+
+
Тест с реактивом Вебера (на гуанидиновую группу)
+
+
+
+
Нингидриновая реакция
+
+
Диазотация
+
+
Тест с реактивом Эрлиха (пара-диэтиламино-бензальдегидом)
+
+
Ацетон+HCl
+
Ванилин+HCl
+
+
+
+
+
Биуретовая реакция
красный
красный
фиолет.
Концентрированная H2SO4
+
Ацетон+H2SO4
+
+
+
Флюоресценция в ультрафиолетовом свете
Таблица 2 Индексы преломления некоторых антибиотиков в твёрдом состоянии, определённые методом погружения
Антибиотик
Пенициллин-калиевая соль
Прокаинпенициллин
Стрептомицин-сульфат
Стрептомицин-хлоргидрат
Хлортетрациклин-хлоргидрат
Окситетрациклин-хлоргидрат
Бацитрацин
Полимиксин В (сульфат)
Эритромицин
1,57−1,58
1,57−1,58
1,55
1,56
1,66−1,67
1,55−1,56
1,54−1,55
1,53
1,45−1,47
Практическую ценность представляет разница между показателем преломления хлортетрациклина и окситетрациклина, на основе которой можно эти два антибиотика различить. Очень специфическими являются микробиологические методы идентификации антибиотиков. Для этого применяются штаммы, специфически резистентные к данному антибиотику, или же так называемые зависимые штаммы, т.е. такие, рост которых обусловлен присутствием определяемого антибиотика. Этот метод особенно надёжен, однако изыскание или выведение таких штаммов является обычно очень трудоёмким делом.
2. Количественное определение антибиотиков
В процессе производства требуется определить содержание антибиотика в культуральной жидкости в ходе ферментации, во всех промежуточных продуктах при выделении и очистке и, наконец, в готовом препарате. Для этого применяют большое количество самых разнообразных биологических и химических методов.
Количество антибиотиков выражают в так называемых единицах действия (ЕД). Определение единицы не одинаково для всех антибиотиков. У антибиотиков, которые были выделены в чистом виде, единица определяется как микрограмм чистого вещества. К сожалению, здесь нет единства, так как у некоторых антибиотиков за единицу принимается микрограмм соли (например, хлортетрациклин солянокислый), а у других − микрограмм основания(например, у стрептомицина).
Активность антибиотических препаратов в твёрдом состоянии выражается количеством единиц в 1 мг вещества. Содержание антибиотика в культуральной жидкости, в концентратах и растворах выражается числом единиц в 1 мл жидкости.
Количественное определение антибиотиков можно проводить как химическими, так и микробиологическими методами. Главными преимуществами химических методов являются их быстрота и сравнительно высокая точность. Преимуществом же микробиологических методов является их намного большая специфичность: посторонние примеси, содержащиеся в испытуемых образцах, не влияют в такой степени на результаты, как это бывает при химических методах.
Микробиологически можно определить и содержание таких антибиотиков, химические и физико-химические свойства которых ещё подробно неизвестны.
2.1 Микробиологическое исследование антибиотиков
Основным принципом микробиологических методов количественного определения активности антибиотика является определение степени задержки роста микроба, чувствительного к данному антибиотику. Культуры или микробы, используемые для этой цели, называются тест-культурами, или тест-микробами. Задержка роста, вызванная определённым количеством используемого материала с неизвестным содержанием антибиотика (например, культуральной жидкости, промежуточного продукта на стадии выделения лекарственно формы препарата и т. п.), сравнивается с задержкой роста тест-культуры, вызванной определённым, известным количеством данного антибиотика (стандартом).
Микробиологические методы определения активности антибиотиков можно в основном разделить на методы, при которых воздействие на тест-культуру исследуется на жидкой среде, и методы, при которых воздействие антибиотика на тест-культуру оценивается с применением твёрдой питательной среды. К первой группе относятся методы серийных разведений и турбидиметрические методы; ко второй группе − методы диффузии в агар на чашках и методы диффузии в агар в капиллярах или пробирках. Основными требованиями, которые необходимо предъявлять к микробиологическим методам количественного определения антибиотиков, являются следующие.
1. Точность.
2. Чувствительность.
3. Простота техники эксперимента.
4. Наиболее короткое время инкубации.
Более или менее совершенное выполнение всех этих требований зависит прежде всего от применяемого метода. Для достижения максимальной чувствительности, кроме того, немалую роль играет культура, используемая для определения. Важным критерием метода является также хорошая воспроизводимость результатов в условиях различных лабораторий.
2.1.1 Методы разведений
Принципом методов разведений является определение количества антибиотика, которое полностью подавляет рост тест-культуры. При этом раствор анализируемого образца с неизвестным содержанием антибиотика и раствор стандарта с известным содержанием антибиотика разводят в геометрической прогрессии питательной средой, предварительно засеянной тест-культурой. По истечении необходимого времени инкубации определяют максимальное разведение образца и стандарта, которое ещё подавляет рост тест-культуры. Путём сравнения этих разведений вычисляют активность исследуемого образца. Вследствие того что оценку проводят по качественному признаку ("растёт"-"не растёт"), этот метод не удовлетворяет первому из перечисленных выше требований. Вместе с тем главным преимуществом методов разведений является их высокая чувствительность, возможность определять очень малые количества антибиотиков, а в некоторых случаях – и короткое время (около 3 часов), необходимое для получения результатов.
При определении содержания антибиотиков в жидкостях тела методом серийных разведений можно использовать индикаторы, реагирующие на изменение рН или окислительно-восстановительного потенциала в процессе роста тест-микроба, например бромкрезоловый красный, метиленовый синий, тимоловый синий, водный синий или феноловый красный и др.
2.1.2 Турбидиметрические методы
Турбидиметрические методы, как и методы разведений, обычно удовлетворяют требованиям, указанным в пп. 2-4, но при этом их точность по сравнению с методами разведений значительно выше ввиду возможности непрерывного проведения количественных измерений.
Принципом, на котором основаны эти методы, является измерение задержки роста тест-организма, проявляющейся в большем или меньшем помутнении питательной среды. Для измерения помутнения используют фотоэлектрические нефелометры. Путём сравнения интенсивности задержки роста, вызванной действием неизвестного количества антибиотика со стандартной кривой, выражающей степень задержки, вызываемой известными количествами антибиотика, производят вычисление активности анализируемого образца. Турбидиметрические методы по сравнению с методами диффузии обычно являются сравнительно менее точными, так как микроорганизм, растущий на жидких питательных средах, при рабочих условиях проведения анализа более чувствителен к изменчивым факторам внешней среды.
На результат могут повлиять и некоторые сопутствующие вещества, содержащиеся в испытуемом образце; при методах диффузии влияние этих веществ вследствие их меньшего проникновения в агар устраняется. Этими веществами являются, например, жирные кислоты или глюкозодегидрогеназа. Эти методы нельзя применять для определения активности антибиотиков в образцах, которые являются либо окрашенными, либо дают мутный раствор, если только это явление нельзя устранить путём соответствующей обработки стандарта.
Источником ошибок могут быть и конечные, неспецифические изменения окраски культуры или изменения помутнения, которые могут произойти, например вследствие изменения рН при выращивании микроорганизмов. Несмотря на это, однако, турбидиметрические методы применяются весьма широко, главным образом потому, что по сравнению с методами диффузии в агар они требуют значительно меньшего времени инкубации.
2.1.3 Методы диффузии в агар
При производстве и разработке технологии получения антибиотиков, пожалуй, наиболее часто применяют методы диффузии в агар, которые по сравнению с предыдущими двумя методами обеспечивают большую точность результатов. В некоторых модификациях с помощью этих методов можно определять даже доли микрограмма антибиотика. Их недостаток состоит в том, что они требуют относительно длительного времени инкубации (примерно 18 часов). По сравнению с турбидиметрическими методами методы диффузии являются более выгодными также и потому, что они обычно требуют меньше места для инкубации.
Методы диффузии в агар на чашках основаны на том, что антибиотик диффундирует из испытуемого образца в питательную агаровую среду, засеянную чувствительной к данному антибиотику культурой. Вокруг образца образуется круглая зона, в пределах которой тест-культура не растёт. Начало этому методу положила оксфордская группа исследователей, которая разработала так называемый метод с цилиндриками. По этому раствор антибиотика (образца и стандарта) заливают в полые цилиндрики, помещённые на поверхность засеянной тест-микробами агаровой среды в чашках Петри. Определение активности производят путём сравнения величин зон задержки роста у образца и стандарта при одном и том же разведении.
При методах диффузии в агар на чашках образующиеся зоны задержки не являются точно круглыми, и, следовательно, измерение их диаметра в разных направлениях даёт непостоянные и тем самым недостаточно точные результаты. От этого недостатка свободны линейные методы диффузии, при которых измеряется задержка роста, получавшаяся вследствие диффузии раствора антибиотика лишь в одном измерении. При этих методах раствор антибиотика либо наливают на засеянную тест-микробами питательную среду в пробирке, либо засеянную питательную среду насасывают в стеклянные капилляры, которые погружают затем в раствор антибиотика. Рост и здесь может быть выявлен вследствие гемолиза или изменения окраски индикатора, добавленного к агаровой питательной среде. Весь процесс может быть в ряде операций механизирован и автоматизирован.
При приготовлении растворов испытуемого образца и стандарта для количественного определения антибиотиков методами диффузии значительно более серьёзной задачей является выбор жидкостей, применяемых для растворения. Обычно для растворения образца и стандарта применяют фосфатные буферные растворы, рН которых выбирают так, чтобы разложение антибиотика было как можно меньшим, а тест-культура была наиболее чувствительной. Для стрептомицина, например, выбирают буфер с рН>7,0, для пенициллина и тетрациклиновых антибиотиков – буфер с рН<7,0.
В соответствии с этим устанавливают и рН используемой для определения агаровой питательной среды. Здесь, однако, нужно иметь в виду, что рН среды влияет на рост тест-организма и что фосфатные анионы оказывают стабилизирующее действие на растворы пенициллина.
Особой проблемой микробиологического определения активности антибиотиков является определение отдельных антибиотиков в смесях методом, отличным от хроматографического. Эта проблема возникла впервые, когда нужно было определять отдельные пенициллины относительно друг друга. Ввиду того что активность отдельных пенициллинов различна при испытании с разными культурами, можно, кроме хроматографического метода, использовать и так называемое дифференциальное титрование, при котором образец, содержащий смесь пенициллинов, титруют либо турбедиметрическим, либо методом диффузии в агар с использованием нескольких различных тест-организмов. Присутствие отдельных пенициллинов в смеси затем рассчитывают на основании соотношения известной активности отдельных пенициллинов против отдельных тест-культур. При определении содержания пенициллина и стрептомицина в лекарственных формах, содержащих смесь этих антибиотиков, можно либо инактивировать пенициллин с помощью пенициллиназы, либо определить пенициллин с микробом, устойчивым к пенициллину. Подобные же методы применяют и при определении других антибиотиков в смесях.
2.2 Определение отдельных составных частей антибиотиков
Многие антибиотики, как, например, пенициллин, стрептомицин, эритромицин, бацитрацин, неомицин, полимиксин и т. д., не являются химически индивидуальными веществами, а представляют собой смесь нескольких структурно сходных веществ. Бумажная хроматография и электрофорез на бумаге позволяют выделить эти составные части и отделить их количественно.
Для изучения антибиотиков можно применять нисходящую, восходящую и горизонтальную хроматографию. Выбор системы растворителей зависит от химической природы антибиотика.
Зоны отдельных антибиотиков выявляются на хроматограммах или электрофотограммах чаще всего биоавтографически, т. е. методом, подобным определению антимикробной активности антибиотиков чашечным методом. Хроматограмму на узкой полоске фильтровальной бумаги после её высушивания кладут на лоток с твёрдой агаровой средой, засеянной суспензией тест-микроба. Лоток помещают на несколько часов в термостат при 37º. В ходе инкубации микроб, посеянный на агар, вырастает, так что агар мутнеет и становится молочно-белым. Он не растёт, однако, вокруг тех мест полосок фильтровальной бумаги, где находятся антибиотически активные вещества. В этих местах остаются чистые прозрачные округлые зоны, которые с первого же взгляда указывают на расположение антибиотически активных составных частей первоначальной смеси. Измеряя диаметр прозрачной зоны, можно установить и количество соответствующей составной части путём сравнения этого диаметра с диаметром зоны стандарта, хроматографируемого одновременно с анализируемыми образцами.
Этот метод применяют для обнаружения антибиотиков и витаминов с той лишь разницей, что витамины выявляются положительно, т. е. микроб растёт лишь в местах, где имеется витамин. Главным достоинством биоавтографии является её чувствительность, которая значительно превосходит чувствительность всех цветных реакций. В этом с нею сравним лишь метод флюоресценции. Это, однако, не говорит о том, что при хроматографировании антибиотиков для их обнаружения не применяют цветные реакции с помощью химических веществ. Этот способ применяют тогда, когда хотят определить составную часть антибиотика, химически подобную ему, но биологически неактивную.
В табл. 3 приведены основные способы хроматографии наиболее употребительных антибиотиков. Если же образец, помимо антибиотика, содержит ещё большое количество солей или иных примесей, то бумажная хроматография может и не дать хороших результатов. В этих случаях можно прибегнуть к электрофорезу га бумаге или же сочетать электрофорез с хроматографией.
Таблица 3 Бумажная хроматография антибиотиков
Антибиотик
Пропитка бумаги
Система растворителей
Проявление
Порядок следования составных частей
Пенициллины
Фосфатный буфер (рН=6,5)
Диэтиловый эфир
Биоавтография (B. Sublitis), (PC-220)
X, G, G, дигидро-F, K
Пенициллины (как гидроксамовые кислоты)
Изопропиловый эфир − изопропанол
Хлорное железо
Стрептомицин
н-Бутанол-пара-толуол-сульфоновая кислота (2%)
Биография
Реакция Сакагуши
Реактив Вебера
Псевдострептомицин; дигидрострептомицин; стрептомицин В; стрептомицин А
Хлорамфеникол
Al2O3
Бензол − метанол − вода (2:1:1)
15% хлорид олова в HCl, затем парадиметил-аминобензальдегид
Хлорамфеникол и различные побочные продукты синтеза
Хлортетрациклин и тетрациклин
−
н-Бутанол − уксусная кислота − вода (4:1:5)
Биоавтография (B. subtilis) (жёлтая флюоресценция в ультрафиолето-вых лучах )
Тетрациклин, хлортетрациклин
Тетрациклиновые антибиотики
Фосфатный буфер (рН=3,0)
Этилацетат
Биоавтография.
Парадиметиламинобензальдегид
Тетрациклин
Окситетрациклин
Хлортетрациклин
Эритромицин
−
Метанол − ацетон − вода (19:6:75)
Биоавтография
Эритромицин В
Эритромицин
Актиномицин
−
н-Дибутиловый эфир, эфир-этилацетат − 2%, водная паратолуолсульфоновая кислота
Реактив Несслера
−
Бумажная хроматография и электрофорез незаменимы при контроле процесса получения антибиотиков путём ферментации. Их главным достоинством является то, что они одинаково хорошо пригодны как для неочищенных растворов, так и для очищенных веществ. Это обусловлено прежде всего специфичностью биоавтографического метода. Ещё большее значение, нежели для технологии, имеет бумажная хроматография для изыскания и изучения новых антибиотиков.
Список использованной литературы
1) Герольд М., Вондрачек М., Несачек Я., Доскочил И. Антибиотики. − Москва: "Медицина", 1966.
2) Кашкин П. Н., Безбородов А. М., Елинов Н. П., Цыганов В. А. Антибиотики. − "Медицина", Ленинградское отделение, 1970.
3) Государственная фармакопея СССР.- 11-е изд.- Вып.I, - М.: Медицина, 1987г.
4) Блинов, Хохлов. Бумажная хроматография антибиотиков.
5) Блок Р. Аналитические методы белковой химии. М 1963; 470.
6) Дэвени Е., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. М: Мир 1976.
Скачать полную версию реферата [33,3 Кб] Информация о работе